MycoLight 比率細菌膜電位試劑盒是用于檢測細菌的試劑盒。MycoLight 比率細菌膜電位試劑盒使用熒光傳感器，在低濃度的革蘭氏陽性和陰性細菌細胞中均呈現(xiàn)綠色熒光，但由于較大的染料分子聚集，熒光在較高的細胞溶質濃度下向紅色發(fā)射轉移膜電位。 膜電位的大小隨著不同的細菌種類而變化。 對于許多革蘭氏陽性物種，紅/綠比率傾向于隨質子梯度的強度而變化，而在許多革蘭氏陰性細菌中，染料的響應似乎與質子梯度強度不成比例。 該試劑盒設計用于在細菌濃度范圍為每毫升105-107個生物體時測定細菌膜電位。 可以在510-530nm（FITC濾光器）和600-660nm（德克薩斯紅色濾光器）下熒光測量染色細胞，激發(fā)波長為最常見的激發(fā)光源488nm。

操作方法

1.在任何適當的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細菌從對數期培養(yǎng)物中獲得健康細菌的最佳結果。在PBS（組分C）或等效的無菌緩沖液中將細菌培養(yǎng)物稀釋至~106個細胞/ mL?？梢灾苯訌呐囵B(yǎng)基中稀釋細菌而不洗滌。準備足夠的懸浮液，每次測試提供500 mL。

2.將500μl細菌懸浮液等分到流式細胞儀管中，進行每個染色實驗。準備兩個額外的管用于去極化控制和未染色的對照。

3.向去極化的對照樣品中加入10μl500μMCCCP（組分B）并混合。

4.向每個流式細胞儀管中加入5μlMycoStainIt Green（100X）（組分A）并混合（不要在未染色的對照樣品上加入染色劑）。在室溫下孵育樣品30分鐘?？稍?分鐘后分析染色樣品，但信號強度繼續(xù)增加直至約30分鐘。

5.可以在配備有發(fā)射488nm的激光的流式細胞儀中測定染色細菌。在綠色（熒光素濾光片）和紅色（德克薩斯紅色濾光片）通道中收集熒光。應使用對數信號放大收集前向散射，側向散射和熒光。

6.儀器調整對于檢測細菌等相對較小的顆粒尤其重要。使用未染色的對照樣品定位前向和側向散射通道中的細菌群。使用側向散射作為設置采集觸發(fā)器的參數。

7.如上所述，在調節(jié)流式細胞儀后應用去極化的對照樣品。使用正向散射和側向散射對細菌進行門控并調整熒光光電倍增管電壓，使得綠色和紅色MFI值近似相等。不要設置補償。

8.雖然紅色和綠色熒光強度的相對量將隨著細胞大小和聚集而變化，但紅色與綠色熒光強度的比率可以用作膜電位的尺寸無關指示。還可以通過使用正向散射與側向散射對細菌進行門控來處理數據，并使用紅色與綠色熒光的點圖分析門控群體，將MFI值報告為線性值，而不是通道。

9.在比率直方圖上，在感興趣的峰周圍設置標記并記錄平均比值。對于紅色與綠色熒光的點圖，設置感興趣群體周圍的區(qū)域并記錄每個的紅色和綠色平均熒光強度（MFI）值。為了評估數據，將紅色種群MFI除以綠色種群MFI。

10.在流式細胞儀中，細菌僅根據其大小和染色能力進行鑒定。最好通過熒光顯微鏡檢查每個樣品，以確認檢測到的顆粒確實是細菌。