半胱氨酸蛋白酶在細(xì)胞凋亡或程序性細(xì)胞死亡中是必需的，在發(fā)育和成年生活的大多數(shù)其他階段，并且因其在細(xì)胞中的作用而被稱為“劊子手”蛋白質(zhì)。免疫系統(tǒng)中也需要一些半胱天冬酶用于淋巴細(xì)胞的成熟。細(xì)胞凋亡失敗是腫瘤發(fā)展和自身免疫疾病的主要原因之一。半胱天冬酶也參與缺血和阿爾茨海默病。凋亡caspase有兩種類型：引發(fā)劑和效應(yīng)劑。 啟動(dòng)子半胱天冬酶（例如，CASP2，CASP8，CASP9和CASP10）切割效應(yīng)半胱天冬酶的無(wú)活性前體形式，從而激活它們。效應(yīng)子半胱天冬酶（例如，CASP3，CASP6，CASP7）依次切割細(xì)胞內(nèi)的其他蛋白質(zhì)底物，以觸發(fā)細(xì)胞凋亡過(guò)程。該級(jí)聯(lián)反應(yīng)的起始受半胱天冬酶抑制劑的調(diào)節(jié)。

操作方法

1.使用AMC，AFC，pNA，R110和ProRed底物的一般溶液Caspase測(cè)定

1.1在DMSO中制備10mM儲(chǔ)備溶液。

1.2制備2X半胱天冬酶底物（50μM）測(cè)定溶液，如下所示：

50 L基質(zhì)原液

100L DTT（1M）

400L EDTA（100 mM）

10mL Tris緩沖液（20mM），pH = 7.4

1.3將等體積的半胱天冬酶標(biāo)準(zhǔn)品或樣品與2X半胱天冬酶底物測(cè)定溶液（來(lái)自步驟1.2）混合，并在室溫下孵育溶液至少1小時(shí)。

1.4使用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光，或使用吸光度酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度。

2.細(xì)胞Caspase檢測(cè)使用細(xì)胞滲透FMK半胱天冬酶探針

2.1在DMSO中制備2-5mM儲(chǔ)備溶液。

2.2根據(jù)需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理。

2.3通過(guò)用20mM Hepes緩沖液（HHBS）稀釋Hanks中的DMSO儲(chǔ)備溶液（來(lái)自步驟2.1），制備2X可滲透的半胱天冬酶底物（20μM）測(cè)定溶液。

2.4用2X半胱天冬酶底物測(cè)定溶液（來(lái)自步驟2.3）混合等體積的處理細(xì)胞，并將細(xì)胞在37℃，5％CO 2培養(yǎng)箱中孵育至少1小時(shí)。

2.5用HHBS洗滌細(xì)胞至少一次。

2.6用流式細(xì)胞儀，熒光顯微鏡或熒光酶標(biāo)儀監(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度。

3.細(xì)胞Caspase檢測(cè)使用細(xì)胞滲透性FMK Caspase探針（僅適用于＃13470-13476）

3.1通過(guò)向小瓶中加入50μLDMSO制備250X儲(chǔ)備溶液。

3.2根據(jù)需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理。

3.3將250 X DMSO儲(chǔ)備溶液（來(lái)自步驟3.1）以1：250的比例（例如2 uL至500 uL細(xì)胞）添加到細(xì)胞溶液中，并將細(xì)胞在37°C，5％CO 2培養(yǎng)箱中孵育1 小時(shí)。

3.4用HHBS洗滌細(xì)胞至少一次。

3.5用流式細(xì)胞儀，熒光顯微鏡或熒光酶標(biāo)儀監(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度。