膜聯(lián)蛋白V是研究細(xì)胞凋亡的有價(jià)值的工具。它用作檢測(cè)在細(xì)胞表面表達(dá)磷脂酰絲氨酸的細(xì)胞的探針，這是細(xì)胞凋亡以及其他形式的細(xì)胞死亡中發(fā)現(xiàn)的特征。有多種參數(shù)可用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞活力。Annexin V-dye共軛物被廣泛用于通過(guò)測(cè)量磷脂酰絲氨酸（PS）的轉(zhuǎn)運(yùn)來(lái)監(jiān)測(cè)細(xì)胞凋亡。在細(xì)胞凋亡中，PS轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜的外部小葉。磷脂酰絲氨酸在細(xì)胞表面的出現(xiàn)是細(xì)胞凋亡初始/中間階段的普遍指標(biāo)，可以在觀察形態(tài)變化之前進(jìn)行檢測(cè)。這種熒光TRITC-Annexin V偶聯(lián)物廣泛用于通過(guò)流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡監(jiān)測(cè)細(xì)胞凋亡。對(duì)于基于膜聯(lián)蛋白V的細(xì)胞凋亡檢測(cè)的微孔板檢測(cè)，我們建議您使用Cell Meter?試劑盒。

操作步驟

1.用膜聯(lián)蛋白V綴合物制備和孵育細(xì)胞：

1.1     制備膜聯(lián)蛋白V綴合測(cè)定緩沖液：10mM HEPES，140mM NaCl和2.5mM CaCl ₂，pH 7.4。

1.2     用測(cè)試化合物處理細(xì)胞一段所需的時(shí)間（用星形孢菌素處理的Jurkat細(xì)胞4-6小時(shí)）以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

1.3     離心細(xì)胞，得到1-5×10 ⁵個(gè)細(xì)胞/管。

1.4     將細(xì)胞重懸于200μLAnnexin V結(jié)合測(cè)定緩沖液中（來(lái)自步驟1.1）。

1.5     在細(xì)胞中加入2μL膜聯(lián)蛋白V結(jié)合物。

可選：在細(xì)胞內(nèi)加入死細(xì)胞染色劑如碘化丙錠，用于壞死細(xì)胞。

1.6     余ncubate在室溫下進(jìn)行30至60分鐘，避光。

1.7     在用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡分析細(xì)胞之前，加入300μLAnnexin V結(jié)合測(cè)定緩沖液（來(lái)自步驟1.1）以增加體積（參見(jiàn)下面的步驟1.8）。

1.8     使用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡監(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度（參見(jiàn)下面的步驟2或3）。

2.使用流式細(xì)胞儀分析：

通過(guò)使用具有適當(dāng)過(guò)濾器的流式細(xì)胞儀來(lái)量化膜聯(lián)蛋白V綴合物。

注意：粘附細(xì)胞上的膜聯(lián)蛋白V 結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)分析未經(jīng)常檢測(cè)，因?yàn)樵诩?xì)胞分離或收獲期間可能發(fā)生特定的膜損傷。

3.使用熒光顯微鏡分析：

3.1     移液器從步驟1.6，將細(xì)胞懸浮液沖洗1-2次用甲nnexin V-結(jié)合測(cè)定緩沖液（來(lái)自步驟1.1） ，然后與A重懸細(xì)胞 nnexin V-結(jié)合測(cè)定緩沖液（來(lái)自步驟1.1） 。將細(xì)胞添加到蓋有玻璃蓋玻片的載玻片上。

注意：對(duì)于粘附細(xì)胞，建議直接在蓋玻片上生長(zhǎng)細(xì)胞。與膜聯(lián)蛋白V綴合物（步驟1.6）孵育后，用Nnexin V結(jié)合測(cè)定緩沖液（來(lái)自步驟1.1）沖洗1-2次，并將A nnexin V結(jié)合測(cè)定緩沖液（來(lái)自步驟1.1）加回到蓋玻片中。在玻璃載玻片上翻轉(zhuǎn)蓋玻片并觀察細(xì)胞。在與膜聯(lián)蛋白V綴合物孵育后，細(xì)胞也可以在2％甲醛中固定，并在顯微鏡下觀察。

3.2     在熒光顯微鏡下用適當(dāng)?shù)臑V光片分析膜聯(lián)蛋白V綴合物的凋亡細(xì)胞。