半胱天冬酶在細胞凋亡和細胞信號傳導(dǎo)中起重要作用。 Caspase 3/7（CPP32 / apopain）的激活對于細胞凋亡的起始是重要的。 Caspase 3/7也被鑒定為藥物篩選靶標。半胱天冬酶抑制劑具有抗癌和其他藥理學(xué)潛力。已經(jīng)證明Caspase 3/7對肽序列Asp-Glu-Val-Asp（DEVD）具有底物選擇性。 我們的Amplite 熒光Caspase 3/7檢測試劑盒使用（Z-DEVD）2 R110作為熒光指示劑，用于檢測caspase 3/7活性。R110衍生的半胱天冬酶底物可能是用于熒光檢測各種半胱天冬酶活性的最敏感的指示劑。R110肽是無色和無熒光的。通過半胱天冬酶裂解R110肽產(chǎn)生強熒光R110，其可以在510-530nm下熒光測量，在488nm激發(fā)，這是最常見的激發(fā)光源。半胱天冬酶誘導(dǎo)的R110水解的熒光增加與半胱天冬酶的活性成比例。

操作方法

1.準備細胞：

1.1對于粘附細胞：在生長培養(yǎng)基中將細胞在20,000至80,000個細胞/孔/ 90L下過夜，96孔板或5,000至20,000個細胞/孔/ 20L，用于384孔板。

1.2對于非粘附細胞：從培養(yǎng)基中離心細胞，然后將細胞沉淀懸浮于培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基濃度為80,000至200,000細胞/孔/ 90L，用于96孔poly-D賴氨酸平板或20,000至50,000細胞/孔/ 20L用于384孔聚-D賴氨酸板。 在實驗之前，在制動器關(guān)閉的情況下以800rpm離心板2分鐘。

注意：應(yīng)對每個細胞系進行單獨評估，以確定誘導(dǎo)細胞凋亡的最佳細胞密度。

2.準備庫存解決方案：

2.1在使用前，在室溫下使用組分A，B，C（如果需要，組分D和E）。

2.2如果需要，制備1mM Caspase 3/7抑制劑Ac-DEVD-CHO儲備液：將100μLDMSO（未提供）直接加入到Ac-DEVD-CHO小瓶（組分D）中。 該抑制劑可用于確認熒光信號強度與Caspase 3/7樣蛋白酶活性之間的相關(guān)性。

注意：應(yīng)將未使用的抑制劑儲備液等分并在-20°C下干燥儲存。

3.準備Caspase 3/7檢測溶液：

將50μL200X胱天蛋白酶3/7底物儲備溶液（組分A）和100μL1MDTT溶液（組分C）加入10mL測定緩沖液（組分B）中，并充分混合。

注意：50μL的200X caspase 3/7底物儲備液足以進行100次測定，每次測定的反應(yīng)體積為100μL。 未使用的200X caspase 3/7底物儲備液應(yīng)等分，在-20°C干燥儲存，避光。

4.運行Caspase 3/7測定：

4.1通過將10μL10X測試化合物（96孔板）或5μL5X測試化合物（384-板）加入PBS或所需緩沖液中來處理細胞。 對于空白孔（沒有細胞的培養(yǎng)基），加入相應(yīng)量的化合物緩沖液。

4.2將細胞板在培養(yǎng)箱中孵育一段所需的時間（用喜樹堿處理的Jurkat細胞4-6小時）以誘導(dǎo)細胞凋亡。

4.3加入100μL/孔（96孔板）或25μL/孔（384孔板）的半胱天冬酶3/7測定溶液（來自步驟3）。

4.4將板在室溫下孵育至少1小時，避光。

注1：如果需要，在室溫下加入測定溶液10分鐘前，將1L Caspase 3/7抑制劑Ac-DEVD-CHO的1mM儲備液（來自步驟2.2）加入選定的樣品中，以確認Caspase 3 / 7個類似的活動。

注2：如果需要，通過將5mM R110標準品（組分E）稀釋到生長培養(yǎng)基中制備R110標準曲線，得到系列稀釋的R110標準品，范圍為0-50M。將100μL連續(xù)稀釋的R110標準品加入含有的孔中。 在測量熒光之前的任何時間，100μLCaspase3/7測定溶液。 該標準曲線可用于測定含有胱天蛋白酶3/7的反應(yīng)中產(chǎn)生的產(chǎn)物的摩爾數(shù)。

4.5在制動器關(guān)閉的情況下，以800rpm離心細胞板（特別是對于非粘附細胞）2分鐘。

4.6在Ex / Em = 490 / 525nm處觀察熒光增加。