我們的Cell Meter 活細(xì)胞半胱天冬酶活性檢測(cè)試劑盒基于半胱天冬酶的熒光抑制劑。這些抑制劑具有細(xì)胞滲透性和非細(xì)胞毒性。一旦進(jìn)入細(xì)胞，半胱天冬酶抑制劑與活性半胱天冬酶共價(jià)結(jié)合。胱天蛋白酶3/7的激活對(duì)于細(xì)胞凋亡的起始是重要的。已經(jīng)證明胱天蛋白酶3/7對(duì)肽序列Asp-Glu-Val-Asp（DEVD）具有底物選擇性。該試劑盒使用TF3-DEVD-FMK作為半胱天冬酶3/7活性的熒光指示劑。TF3-DEVD-FMK在凋亡細(xì)胞中不可逆地結(jié)合活化的胱天蛋白酶3/7。一旦與胱天蛋白酶3/7結(jié)合，熒光試劑保留在細(xì)胞內(nèi)。結(jié)合抑制caspase 3/7，但不會(huì)阻止細(xì)胞凋亡的進(jìn)行。有多種參數(shù)可用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞凋亡。這種Cell Meter 活細(xì)胞半胱天冬酶3/7活性測(cè)定試劑盒旨在通過測(cè)量活細(xì)胞中胱天蛋白酶3/7的活化來檢測(cè)細(xì)胞凋亡。它用于定量凋亡細(xì)胞中活化的caspase 3/7活性，或用于篩選caspase 3/7抑制劑。TF3-DEVD-FMK，紅色標(biāo)記試劑，允許通過熒光顯微鏡，流式細(xì)胞儀或熒光酶標(biāo)儀直接檢測(cè)凋亡細(xì)胞中活化的半胱天冬酶3/7。該試劑盒為所有必需組分提供優(yōu)化的分析方案。

操作方法

1.根據(jù)您的特異性誘導(dǎo)方案，將細(xì)胞培養(yǎng)至最適于細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)的密度，但不超過2 x 10^6個(gè)細(xì)胞/ mL。同時(shí)，對(duì)于每種標(biāo)記條件，以與誘導(dǎo)群體相同的密度培養(yǎng)非誘導(dǎo)的陰性對(duì)照細(xì)胞群。以下是一些誘導(dǎo)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞凋亡的例子：

1）用2μg/ ml喜樹堿處理Jurkat細(xì)胞3小時(shí)。

2）用1μM星形孢菌素處理Jurkat細(xì)胞3小時(shí)。

3）用4μg/ ml喜樹堿處理HL-60細(xì)胞4小時(shí)。

4）用1μM星形孢菌素處理HL-60細(xì)胞4小時(shí)。

注意：應(yīng)對(duì)每個(gè)細(xì)胞系進(jìn)行單獨(dú)評(píng)估，以確定誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的最佳細(xì)胞密度。

2.通過向TF3-DEVD-FMK（組分A）的小瓶中加入50μLDMSO制備150X TF3-DEVD-FMK DMSO儲(chǔ)備溶液。 將150×TF3-DEVD-FMK以1：150的比例加入細(xì)胞溶液中，并將細(xì)胞在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中孵育1小時(shí)。

注1：對(duì)于TF3-DEVD-FMK標(biāo)記，細(xì)胞可以濃縮至~5×10^6個(gè)細(xì)胞/ mL。 未使用的150X TF3-DEVD-FMK DMSO儲(chǔ)備溶液應(yīng)分為單次使用的等分試樣并儲(chǔ)存在-20°C。

注2：對(duì)于粘附細(xì)胞，用0.5mM EDTA輕輕提起細(xì)胞以保持細(xì)胞完整，并在用TF3-DEVD-FMK孵育之前用含血清的培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞一次。

注3：適當(dāng)?shù)姆跤龝r(shí)間取決于所用的細(xì)胞類型和細(xì)胞濃度。 優(yōu)化每個(gè)實(shí)驗(yàn)的孵育時(shí)間。

3.將細(xì)胞以約200g旋轉(zhuǎn)5分鐘，并用1mL洗滌緩沖液（組分B）洗滌細(xì)胞兩次。 將細(xì)胞重懸于所需量的洗滌緩沖液中。

注1：TF3-DEVD-FMK是熒光的，因此清除任何未結(jié)合的試劑以消除背景非常重要。

注2：對(duì)于分離的細(xì)胞，應(yīng)將細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)至每個(gè)微量滴定板孔中2-5×10^5個(gè)細(xì)胞/100μL等分試樣，用于步驟5。

4.如果需要，用DNA染色標(biāo)記細(xì)胞（例如用于死細(xì)胞的Nuclear Green DCS1，或用于細(xì)胞核染色的整個(gè)群體的Hoechst）。

5.通過熒光顯微鏡，流式細(xì)胞儀或熒光酶標(biāo)儀在Ex / Em = 550/595 nm處檢測(cè)熒光強(qiáng)度（對(duì)于Nuclear Green DCS1，Ex / Em = 490/525 nm，對(duì)于Hoechst染料，Ex / Em = 350/461 nm）

5.1對(duì)于流式細(xì)胞儀，使用Ex / Em = 550/595 nm（用于Nuclear Green DCS1染色的FL1通道）的通道監(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度。

5.2用于熒光顯微鏡和熒光酶標(biāo)儀。 將100μL細(xì)胞懸浮液置于96孔黑色微量滴定板的每個(gè)孔中。

注意：如果需要平衡細(xì)胞濃度，調(diào)整誘導(dǎo)細(xì)胞的懸浮體積以接近非誘導(dǎo)細(xì)胞群的細(xì)胞密度。 如果您的細(xì)胞治療不會(huì)導(dǎo)致受刺激細(xì)胞群數(shù)量的顯著損失，則此調(diào)整步驟是可選的。

5.3使用TRITC通道（用于Nuclear Green DCS1染色的FITC通道，用于Hoechst染色的DAPI通道）在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞。

5.4使用熒光酶標(biāo)儀，使用Ex / Em = 550/595 nm（在570 nm處截止）底部讀取模式監(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度。